Luigi Ricciardi 1 , Rosa Mazzeo 2,*© , Angelo Raffaele Marcotrigiano 1 , Guglielmo Rainaldi 3 , Paolo Iovieno 4 , Vito Zonno 1 , Stefano Pavan 1© i Concetta Lotti 2,*
- 1 Odjel za tlo, biljke i prehrambene znanosti, Jedinica za biljnu genetiku i oplemenjivanje Sveučilišta u Bariju, Via Amendola 165/A, 70125 Bari, Italija; luigi.ricciardi@uniba.it (LR);angelo.marcotrigiano@uniba.it (RUKA); vito.zonno@uniba.it (VZ); stefano.pavan@uniba.it (SP)
- 2 Odjel za znanosti o poljoprivredi, hrani i okolišu, Sveučilište u Foggii, Via Napoli 25, 71122 Foggia, Italija
- 3 Odjel za bioznanosti, biotehnologiju i biofarmaceutiku, Sveučilište u Bariju, Via Orabona 4, 70125 Bari, Italija; guglielmo.rainaldi@uniba.it
- 4 Odjel za energetske tehnologije, Odjel za bioenergiju, biorafinerije i zelenu kemiju, Istraživački centar ENEA Trisaia, SS 106 Ionica, km 419+500, 75026 Rotondella (MT), Italija; paolo.iovieno@enea.it
* Dopisivanje: rosa.mazzeo@unifg.it (RM); concetta.lotti@unifg.it (CL)
Sažetak:
Luk (Allium cepa L.) je druga najvažnija povrtna kultura u svijetu i naširoko je cijenjena zbog svojih zdravstvenih prednosti. Unatoč značajnoj ekonomskoj važnosti i vrijednosti kao funkcionalne hrane, luk je slabo istražen u pogledu svoje genetske raznolikosti. Ovdje smo istražili genetsku varijaciju u "Acquaviva crvenom luku" (ARO), autohtonoj rasi sa stoljetnom poviješću uzgoja u malom gradu u pokrajini Bari (Apulija, južna Italija). Skup od 11 mikrosatelitnih markera korišten je za istraživanje genetske varijacije u kolekciji germplazme koja se sastoji od 13 ARO populacija i tri uobičajena komercijalna tipa. Analize genetičke strukture parametarskim i neparametarskim metodama istaknule su da ARO predstavlja dobro definiran genski fond, jasno različit od domaćih rasa Tropea i Montoro s kojima se često griješi. Kako bi se pružio opis lukovica koje se obično koriste za svježu potrošnju, procijenjeni su sadržaj topljive krutine i ljutina, pokazujući veću slatkoću u ARO u odnosu na dvije gore navedene domaće sorte. Općenito, ova je studija korisna za buduću valorizaciju ARO-a, što bi se moglo promovirati putem oznaka kvalitete koje bi mogle pridonijeti ograničavanju komercijalnih prijevara i poboljšanju prihoda malih posjednika.
Uvod
Rod Allium broji oko 750 vrsta [1], među kojima je luk (Allium cepa L., 2n = 2x =16) jedan od najraširenijih. A. cepa ima dvogodišnji ciklus i spolno križanje. Današnja svjetska proizvodnja luka (97.9 Mt) čini ga drugom najvažnijom povrtnom kulturom nakon rajčice [2]. Od davnina se lukovica luka koristila i kao hrana i u narodnoj medicini. Doista, stari Egipćani već su izvijestili o nekoliko terapeutskih formula koje se temelje na upotrebi češnjaka i luka u medicinskom papirusu iz 1550. godine prije Krista, Codex Ebers [3].
Ovo svestrano i zdravo povrće konzumira se sirovo, svježe ili kao prerađevina, a koristi se za poboljšanje okusa mnogih jela. Nekoliko nedavnih studija tvrdi da konzumacija luka može smanjiti rizik od kardiovaskularnih bolesti [4,5], pretilosti [6], dijabetesa [7] i raznih oblika raka [8-10]. Zdravstvena svojstva luka često se pripisuju visokim razinama dviju klasa nutritivnih spojeva: flavonoida i alk(en)il cistein sulfoksida (ACSO). Prva klasa uključuje flavonole i antocijane. Kvercetin je flavonol koji se najviše može otkriti, poznat po svojim snažnim antioksidativnim i protuupalnim svojstvima u hvatanju slobodnih radikala i vezivanju iona prijelaznih metala [11]; dok antocijanini daju crvenu/ljubičastu boju nekim sortama luka. Što se tiče ACSO, najzastupljeniji je izoaliin [(+)-trans-S-1-propenil-L-cistein sulfoksid] [12], nehlapljiva i neproteinogena sumporna aminokiselina pohranjena u stanicama, koja je neizravno odgovorna za opor miris i okus luka [13]. Nakon razaranja tkiva, izoaliin se cijepa pomoću enzima aliinaze kako bi se proizveo niz hlapljivih spojeva (piruvat, amonijak, tiosulfonati i propanetialni S-oksid) koji potiču suzenje i uzrokuju neugodan miris (oporost) [14]. Oporost luka često se mjeri kao količina, po gramu svježe težine, pirogrožđane kiseline nastale hidrolizom [15.16].
U zemljama mediteranskog bazena, predložen kao jedno od sekundarnih središta raznolikosti A. cepa [17.18], lukovice luka pokazuju veliku varijabilnost u obliku, veličini, boji, suhoj tvari i ljutini [19-jedan]. Štoviše, gnojidba na bazi sumpora, agronomske prakse, tip tla, klimatski uvjeti i genotip kultivara ili domaćih sorti mogu utjecati na kvalitetu lukovica dajući osobite organoleptičke i nutritivne vrijednosti [23-jedan]. U Italiji, unatoč širokoj dostupnosti germplazme luka, samo je nekoliko sorti luka često podvrgnuto znanstvenim studijama i pravilno karakterizirano [28.29].
Temeljita genetička i fenotipska karakterizacija agrobioraznolikosti ključna je za osiguranje odgovarajućeg očuvanja biljnih genetskih resursa i promicanje upotrebe specifičnih genotipova u lancu vrijednosti [30-jedan]. Oznake jednostavnog ponavljanja sekvence (SSR) često su odabrane za mapiranje [33-jedan], DNK otisak prsta i diskriminacija kultivara [36-jedan]i pouzdanu procjenu genetske varijabilnosti unutar i među domaćim rasama [39-jedan]budući da su specifični za lokus, multialelni, kodominantno naslijeđeni, visoko reproducibilni i prikladni za automatizirano genotipiziranje.
U ovoj smo studiji svoju pozornost usmjerili na apulijsku tradicionalnu domaću sortu, „Acquaviva crveni luk” (ARO), koji se uzgaja prema metodama organskog uzgoja na malom području grada Acquaviva delle Fonti, u pokrajini Bari. (Apulija, južna Italija). Lukovice ove domaće rase su velike, spljoštene i crvene boje te se uglavnom koriste u lokalnim receptima. Iako je ARO dobio oznaku kvalitete “Slow Food Presidium”, njegova bi proizvodnja mogla biti dodatno promicana i zaštićena oznakama kvalitete Europske unije kao što su zaštićena oznaka zemljopisnog podrijetla (PGI) i zaštićena oznaka izvornosti (POD), jer bi one mogle doprinijeti ograničavanju komercijalne prijevare i poboljšati prihode malih posjednika. Ovdje su molekularni markeri SSR korišteni kao moćni alati za procjenu genetske varijacije među ARO populacijama i za razlikovanje ove domaće sorte od druge dvije južnotalijanske domaće sorte crvenog luka. Nadalje, procijenili smo ljutinu i sadržaj topljive čvrste tvari kako bismo ocijenili okus ARO u odnosu na potražnju na tržištu.
Rezultati
Uspostava zbirke germplazme crvenog luka Acquaviva i morfološka karakterizacija
Sjeme 13 populacija ARO landrace koje su donirali farmeri u okviru projekta BiodiverSO Apulia Region korišteno je za uspostavljanje kolekcije ARO germplazme.
Morfološki deskriptori koji se odnose na lukovicu, kožicu i meso prikupljeni su na ARO germplazmi i na tri domaće sorte luka, dvije pripadaju lokalnoj sorti „Tropea red onion” (TRO), a jedna domaće sorti „Montoro copper onion” (MCO) (Slika 1). Sve ARO lukovice bile su plosnate i karakterizirane su crvenom vanjskom opnom i mesom s različitim nijansama crvene boje. Nasuprot tome, meso TRO lukovica bilo je potpuno crveno, dok je meso MCO lukovica bilo slabo pigmentirano (Tablica S1). Biokemijska analiza omogućila je procjenu udjela krutih tvari i oporosti. Kao što je navedeno u tablici 1, srednje vrijednosti udjela krutih topljivih tvari u lukovicama u ARO populacijama bile su 7.60, a kretale su se od 6.00 (ARO12) do 9.50° Brix (ARO11 i ARO13). Ova je vrijednost bila viša od one procijenjene za TRO i MCO domaće rase (4.25 odnosno 6.00° Brixa).
Tablica 1. Sadržaj krutih topljivih tvari i vrijednosti ljutine procijenjene u populacijama "Acquaviva crvenog luka" (ARO), "Tropea crvenog luka" (TRO) i "Montoro bakrenog luka" (MCO) *.
KODEKS | Topljivi čvrsti sadržaj (Brix) | Oporost (pmolg-1 FW) | ||
značiti | CV y (%) | značiti | CV y (%) | |
ARO1 | 6.25 D * | 5.65 | 5.84 ab * | 23.78 |
ARO2 | 7.25 DC | 4.87 | 6.51 | 22.98 |
ARO3 | 7.50 XNUMX XNUMX BCD | 9.42 | 5.28 od | 22.88 |
ARO4 | 7.50 XNUMX XNUMX BCD | 0.00 | 6.97 | 3.74 |
ARO 5 | 7.50 XNUMX XNUMX BCD | 0.00 | 6.80 | 9.68 |
ARO6 | 6.25 D | 5.65 | 4.51 od | 39.18 |
ARO7 | 7.25 DC | 4.87 | 5.25 od | 15.44 |
ARO8 | 9.00 AB | 0.00 | 7.04 | 3.49 |
ARO9 | 8.25 ABC | 4.28 | 6.84 | 0.15 |
ARO10 | 7.00 DC | 0.00 | 5.94 od | 6.57 |
ARO11 | 9.50 | 7.44 | 5.54 od | 16.43 |
ARO12 | 6.00 D | 0.00 | 4.91 od | 9.70 |
ARO13 | 9.50 | 7.44 | 6.63 | 24.93 |
OKK | 6.00 D | 0.00 | 4.18 od | 2.66 |
TRO1 | 4.25 E | 8.31 | 2.80 b | 2.10 |
TRO2 | 4.25 E | 8.31 | 4.28 od | 4.79 |
* Srednje vrijednosti s istim slovima u velikim ili malim slovima nisu statistički različite na 0.01P odnosno 0.05P (SNK-ov test). y Koeficijent varijacije.
Srednja vrijednost ljutine ARO, procijenjena sadržajem pirogrožđane kiseline, bila je 6.00, kretala se od 4.51 pmol g-1 FW (ARO6) do 7.04 (ARO8). Ova je vrijednost bila viša od one procijenjene za TRO i MCO domaće rase (3.54 pmol g-1 FW i 4.18 pmol g-1 FW, odnosno).
SSR polimorfizam i genetski odnosi među primjescima
U ovoj studiji, 11 od 37 testiranih kombinacija SSR početnica pružilo je polimorfizme jednog lokusa, tj. davanje najviše dva produkta pojačanja u jednoj jedinki. Sveukupno, 55 alela otkriveno je u 320 pojedinaca s brojem alela po lokusu u rasponu od 2 (ACM147 i ACM 504) do 11 (ACM132) i srednjom vrijednošću od 5 alela (tablica 2). U pojedinim populacijama broj alela (Na) kretao se od 1.94 (ACM147 i ACM504) do 5.38 (ACM132), dok je efektivni broj alela (Ne) bio u rasponu od 1.41 (ACM152) do 2.82 (ACM449). Odstupanja između Na i Ne vrijednosti bile su zbog prisutnosti alela s niskom učestalošću u populacijama i dominacije samo nekoliko alela. Najveća promatrana vrijednost heterozigotnosti (Ho) istaknuta je za ACM138 i ACM449 (0.62), dok je najniža povezana s ACM152 (0.25). Očekivana heterozigotnost (He), koja odgovara teoretskom očekivanju u panmiktičkoj populaciji, bila je u rasponu od 0.37 (ACM504) do 0.61 (ACM132, ACM138 i ACM449). Wrightov indeks fiksacije (Fis) pokazao je vrijednosti blizu nule (prosječno 0.05) za sve markere, ukazujući na slične vrijednosti između promatranih i očekivanih razina heterozigotnosti, kao što se očekuje za vrste koje se križaju. Učinkovitost pojedinog SSR markera u genetskom otisku prsta procijenjena je indeksom sadržaja polimorfnih informacija (PIC), sa srednjom vrijednošću od 0.48 i u rasponu od 0.33 (ACM504) do 0.67 (ACM132). Drugi indeks učinkovitosti, Shannonov informacijski indeks (I) pokazao je srednju vrijednost od 0.84, a pretpostavljene vrijednosti su bile u rasponu od 0.45 (ACM152) do 1.20 (ACM132).
Tablica 2. Značajke polimorfizma 11 SSR markera koji se koriste za procjenu genetske raznolikosti u ARO, TRO i MCO populacijama. Ukupan broj alela (Na), raspon veličine pojasa i indeks sadržaja polimorfnih informacija (PIC) Odnosi se na ukupni skup od 320 pojedinaca genotipiziranih u ovoj studiji. Broj alela (Na), broj efektivnih alela (Ne), uočena heterozigotnost (Ho), očekivana heterozigotnost (He), indeks fiksacije (Fis), a Shannonov informacijski indeks (I) odnosi se na srednje vrijednosti izračunate iz 16 populacija, od kojih se svaka sastoji od 20 pojedinaca.
Mjesto. | Ukupno Na | Raspon veličina (bp) | PIC | značiti | |||||
Na | Ne | Ho | He | I | Fis | ||||
ACM91 | 4 | 189-205 | 0.40 | 2.63 | 1.72 | 0.38 | 0.39 | 0.66 | 0.04 |
ACM101 | 4 | 229-241 | 0.52 | 2.94 | 2.37 | 0.53 | 0.56 | 0.92 | 0.06 |
ACM132 | 11 | 186-248 | 0.67 | 5.38 | 2.78 | 0.55 | 0.61 | 1.20 | 0.09 |
ACM138 | 5 | 242-272 | 0.66 | 3.69 | 2.82 | 0.62 | 0.61 | 1.09 | -0.02 |
ACM147 | 2 | 264-266 | 0.37 | 1.94 | 1.83 | 0.44 | 0.44 | 0.62 | -0.01 |
ACM152 | 4 | 228-244 | 0.25 | 2.38 | 1.41 | 0.25 | 0.27 | 0.45 | 0.07 |
ACM235 | 4 | 286-298 | 0.41 | 2.81 | 1.77 | 0.44 | 0.41 | 0.72 | -0.06 |
ACM446 | 6 | 108-120 | 0.56 | 3.50 | 2.48 | 0.49 | 0.58 | 1.01 | 0.16 |
ACM449 | 8 | 120-140 | 0.66 | 4.88 | 2.82 | 0.62 | 0.61 | 1.18 | -0.03 |
ACM463 | 5 | 202-210 | 0.47 | 3.38 | 1.95 | 0.46 | 0.48 | 0.83 | 0.05 |
ACM504 | 2 | 188-192 | 0.33 | 1.94 | 1.64 | 0.30 | 0.37 | 0.54 | 0.20 |
značiti | 5 | 0.48 | 3.22 | 2.15 | 0.46 | 0.48 | 0.84 | 0.05 |
Među populacijama, ARO3, ARO6, ARO8, ARO10, TRO1 i MCO pokazali su visoku razinu genetske varijacije (Ho > 0.5), dok je najmanja raznolikost primijećena u populaciji ARO7 (Ho = 0.27) (dodatna tablica S2). Sve u svemu, svi pristupi su pokazali Fis vrijednosti blizu nule (Fis srednja vrijednost = 0.054), kao što se i očekivalo u uvjetima slučajnog parenja.
Analiza molekularne varijance i genetske strukture
AMOVA je izračunala hijerarhijsku podjelu genetske varijacije između i unutar populacija. Rezultati su istaknuli značajan udio genetske varijacije unutar populacije (87%). Varijacije među populacijama, 13%, bile su vrlo značajne (P < 0.001) (Tablica 3). Vrijednosti parametra Fpt, analognog Wrightovom Fst indeksu fiksacije, u rasponu od 0.002 (ARO2/ARO10) do 0.468 (ARO7/TRO2), bile su značajne (P < 0.05), osim za devet usporedbi po parovima (dodatna tablica S3).
Tablica 3. Analiza molekularne varijance 320 genotipova iz 16 populacija Allium cepa L.
izvor | df | Zbroj kvadrata | Procjena varijance | Varijansa (%) | Fpt | P |
Među populacijama | 15 | 458.63 | 1.16 | 13% | ||
Unutar populacija | 304 | 2272.99 | 7.50 | 87% | 0.134 | 0.001 |
ukupno | 319 | 2731.62 | 8.66 |
Istraživanje genetske strukture u A. cepa kolekcija genotipizirana u ovoj studiji provedena je pomoću analize klasteriranja temeljene na modelu primjesa implementirane u softveru STRUCTURE. Metoda Evanno AK predložila je podjelu u dva klastera (K = 2) kao najinformativniju za naše skup podataka,s the sljedeći najviši peak kod K = 5 (dodatna slika S1). za K = 2, ahpopulacije wprije magarcaigned istonif dva klastera s rnernbertoip koeficijent (q) > 0.7. Kao shown in Lik 2a, prvi klaster (nazvan S1) uključivao je MCO i sve ARO populacije, dok je S2 klaster grupirao dvije TRO populacije. Na K = 5, dajući dublji opis skupa podataka (Slika 2b), 75% pristupa je dodijeljeno jednom od pet klastera. Potvrđeno je razdvajanje između ARO (S1) i TRO (S2), iako su neke ARO populacije bile pomiješane (q < 0.7) ili odvojeno grupirane u dva nova skupa S3 i S4 (ARO7 i ARO12). Zanimljivo je da je komercijalni tip MCO formirao poseban klaster (S5) odvojen od apulijskog crvenog luka.
Genetski odnosi među populacijama
SSR polimorfizam omogućio je crtanje dendrograma genetske raznolikosti, a rezultati filogenetske analize prikazani su na slici 3a. Ovdje je kolekcija germplazme podijeljena u pet skupina snažno podržanih početnim vrijednostima. Populacije ARO7 i ARO12 odmah su odvojene od preostalih populacija i formirale su dvije različite skupine. Treći klaster uključivao je dvije komercijalne populacije TRO, dok je četvrti čvor dijelio MCO od jedanaest ARO populacija. Genetski odnos koji se javlja među populacijama dodatno je istražen pomoću analize glavnih koordinata (PCoA) (Slika 3b). Kao što je prethodno naglašeno, ARO populacije su grupirane usko, osim ARO12 i ARO7, koji su se pojavili na izoliranim pozicijama u PCoA dijagramu. Dva TRO-a i MCO populacije bili su razbacani u donjem desnom dijelu crteža.
Slika 3. Genetska raznolikost među 16 A. cepa populacije karakterizirane u ovoj studiji, na temelju njihovog SSR profila. (a) UPGMA dendrogram genetske udaljenosti. Vrijednosti podrške za bootstrap >50 naznačene su iznad odgovarajućih čvorova; (b) analiza glavnih komponenti (PCoA). Skupina zaokružena crvenom bojom u potpunosti se podudara sa skupinom generiranom filogenetskom analizom koju čini 11 ARO pristupa.
Rasprava
Unutar velike količine agrobiološke raznolikosti koja se tradicionalno uzgaja u južnoj Italiji, domaće sorte luka predstavljaju nišne proizvode koje je potrebno sačuvati od rizika genetske erozije i prijetnje zamjene modernim kultivarima. U okviru regionalnog projekta BiodiverSO, usmjerenog na prikupljanje, karakterizaciju, promicanje i zaštitu genetskih resursa regije Apulije koji su snažno povezani s lokalnom baštinom, uspostavili smo zbirku sjemena 13 populacija ARO landrace. Izvijestili smo o prvoj procjeni varijacije ARO u smislu polimorfizama DNA i dvaju biokemijskih parametra, sadržaja topljive krutine i pirogrožđane kiseline, povezanih sa svojstvima okusa i važnih za prihvaćanje svježih nekuhanih proizvoda. Osim toga, podaci o ARO domaće sorte uspoređeni su s onima prikupljenim na dvije druge pigmentirane domaće sorte luka s kojima se često griješilo.
Biokemijske analize istaknule su slatkoću 13 ARO populacija, povezanu s visokim sadržajem topljivih čvrstih tvari i srednjom ljutinom, u skladu sa smjernicama industrije slatkog luka [31]. ARO lukovice bile su slađe od onih TRO i MCO domaćih rasa i pokazale su malo veću pikantnost. Međutim, slatkoća u luku je rezultat ravnoteže između sadržaja šećera i ljutine, stoga bi ova karakterizacija mogla biti korisna za potporu odabira vrijednih genotipova, koji poljoprivrednici obično provode samo na temelju morfologije.
Potvrđeno je da su SSR markeri koristan alat za razlikovanje genotipova, iako prikupljeni unutar uskog područja uzgoja kao što je grad Acquaviva delle Fonti. Odabrani markeri pokazali su veći broj alela od prethodno prijavljenih markera [43] i [44], ali niže od markera koje je prijavio [45]. Štoviše, 50% našeg skupa markera pokazalo je vrijednosti PIC indeksa veće od 0.5, što se pokazalo prikladnim za razlikovanje populacija u kolekciji, kao što sugerira [46]. Procjena raznolikosti unutar populacija otkrila je slične vrijednosti između Ho i He, što je rezultiralo niskim Fis vrijednosti. To je u skladu s prirodom prelaska A. cepa, koja ozbiljno pati od inbreeding depresije [47]. Ukupni Fis vrijednost izračunata u populacijama luka razmatranim u ovoj studiji (0.054) bila je niža od one koju je prethodno objavio [45] (0.22) i gotovo identična onoj koju je pronašao [31] (0.08) i [48] (0.00) koji su procijenili genetsku raznolikost domaćih sorti luka iz sjeverozapadne Španjolske i Nigera. Značajne razine heterozigotnosti u ARO populacijama potvrđuju ideju da Apulija predstavlja središte raznolikosti za mnoge hortikulturne vrste [32, 42, 49-jedan].
AMOVA je istaknula da većina molekularnih varijacija u zbirci genotipiziranoj u ovoj studiji leži unutar populacija. Međutim, značajna genetska diferencijacija među populacijama (FPT vrijednosti) otkrili su pojavu genetske stratifikacije. Zapravo, iako su naši rezultati ukazivali na prisutnost genetske uniformnosti u većini ARO populacija, tvoreći dobro definiran klaster, ARO7 i ARO12 populacije pokazale su jasno različit genetski profil. Ovaj rezultat mogao bi biti posljedica različitog podrijetla sjemena koje su koristila dva farmera od kojih su prikupljene populacije. Štoviše, na temelju dobivenih rezultata, ARO domaće rase se mogu smatrati jasno različitim na genetskoj razini od TRO i MCO domaćih rasa. U nedavnoj studiji, [29] procijenio je genetsku raznolikost nekoliko domaćih sorti talijanskog luka uključujući "Acquaviva", "Tropea" i "Montoro". Iako su autori koristili SNP markere za procjenu genetske raznolikosti šire zbirke luka, genotipizacija nije uspjela razlikovati "Acquaviva" od "Tropea" i "Montoro" luka. Vjerojatno je ovo odstupanje posljedica niske srednje vrijednosti PIC (0.292), što ukazuje na skromnu opću informativnost lokusa koji se analiziraju kako tvrdi [29]. Nadalje, kako bi se istražila prisutnost podstrukture u njihovom talijanskom klasteru, bilo bi bolje analizirati talijanske genotipove odvojeno od ostatka zbirke. Vjerojatno bi to omogućilo vizualizaciju uzorka genetske raznolikosti povezanog s geografskom stratifikacijom ili osobinama pod empirijskim odabirom.
Zaključno, ova studija predstavlja sveobuhvatno izvješće o domaćem luku povezanom s lokalnom kulturnom baštinom i od gospodarske važnosti za poljoprivrednike. Naši rezultati naglašavaju da, uz nekoliko iznimaka, ARO karakterizira dobro definiran genski fond, koji zaslužuje biti sačuvan od rizika genetske erozije. Stoga je uspostava reprezentativne zbirke ovog vrijednog izvora genetske raznolikosti bila ključna. Konačno, genetička i fenotipska karakterizacija ARO-a mogla bi biti korisna za dobivanje oznaka kvalitete od Europske unije.
Materijali i metode
Prikupljanje germplazme, biljni materijal i ekstrakcija DNA
Skup od 13 populacija ARO landrace nabavljen je u okviru projekta regije Apulija (BiodiverSO: https://www.biodiversitapuglia.it/), kroz niz misija provedenih u “Acquaviva delle Fonti”, malom apulijskom gradu u pokrajini Bari, Italija. Mjesta sakupljanja svakog pristupa mapirana su putem Geografskog informacijskog sustava (GIS) i navedena u tablici 4. Osim toga, dvije populacije iz TRO domaće rase i jedna populacija iz MCO domaće rase uključene su u ovu studiju i korištene kao reference. Sav biljni materijal uzgojen je u istim uvjetima okoliša na eksperimentalnoj farmi “P Martucci” Sveučilišta u Bariju (41° 1'22.08″ N, 16°54'25.95″ E), pod zaštitnim kavezom kako bi se izbjeglo unakrsno oprašivanje između populacije i osiguravanje unutarpopulacijskog oprašivanja pomoću puhalica (Lucilija cezar). Za 16 populacija karakterizirane su osobine povezane s veličinom i oblikom lukovice te bojom kožice i mesa (Tablica S1). Osim toga, ispitivanje sadržaja krutine topljive je provedeno korištenjem ručnog refraktometra, a ljutina je mjerena u uzorcima soka od luka uz dodatak 2,4-dinitrofenil hidrazina (0.125% v/v u 2N HCl) i procjenom apsorbancije na 420 nm, kako je izvijestio [31]. Provedeni su Duncanov test višestrukog raspona i SNK test kako bi se utvrdilo postojanje značajnih razlika.
Tablica 4. Popis populacija prikupljenih i genotipiziranih u ovoj studiji. Za svaku populaciju navodi se identifikacijski kod, lokalni naziv, GPS koordinata i banka gena koja čuva sjeme.
Kodirati | Ime i Prezime | GPS koordinate | Banka gena y |
ARO1 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54’21.708″ N 16°49’1.631” E | Di.SSPA |
ARO2 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°53’14.28″ N 16°48’56.879” E | Di.SSPA |
ARO3 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54’11.304″ N 16°49’13.079” E | Di.SSPA |
ARO4 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54’3.348″ N 16°40’27.011” E | Di.SSPA |
ARO5 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°51’59.76″ N 16°53’0.527” E | Di.SSPA |
ARO6 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°52’48.72″ N 16°49’43.247” E | Di.SSPA |
ARO7 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°53’13.47″ N 16°50’23.783” E | Di.SSPA |
ARO8 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°53’18.816″ N 16°49’33.888” E | Di.SSPA |
ARO9 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54'51.372" N 16°49'3.504" E | Di.SSPA |
ARO10 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54’1.188″ N 16°49’24.311” E | Di.SSPA |
ARO11 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°52'49.8" N 16°49'48.575" E | Di.SSPA |
ARO12 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°52’38.892″ N 16°49’28.379” E | Di.SSPA |
ARO13 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°53’21.768″ N 16°49’29.711” E | Di.SSPA |
TRO1 | Cipolla rossa lunga di Tropea | - | Di.SSPA |
TRO2 | Cipolla rossa tonda di Tropea | - | Di.SSPA |
OKK | Cipolla ramata di Montoro | - | Di.SSPA |
y Di.SSPA, Odjel za tlo, biljke i prehrambene znanosti, Sveučilište u Bariju. |
Uzorkovan je lisni materijal 20 genotipova po populaciji i do upotrebe pohranjen na -80 °C. Za vrste bogate polisaharidima, kao A. cepa, prvi koraci uklanjanja polisaharida ključni su za dobivanje DNK dobre kvalitete, stoga su početna ispiranja u STE puferu (0.25 M saharoza, 0.03 M Tris, 0.05 M EDTA) izvedena kako je opisano u [52]. Ukupna DNA ekstrahirana je CTAB metodom [53] i konačno je provjerena kvaliteta i koncentracija Nano Drop 2000 UV-vis spektrofotometrom (ThermoScientific, Waltham, MA, SAD) i elektroforezom na 0.8% agaroznom gelu.
SSR analiza
16 EST-SSR kombinacija primera koje je razvio [54] i prethodno ispitan u studijama genetičke raznolikosti [43] i [44] i 21 genomski SSR [45-jedan] pregledani su kako bi se procijenila njihova prikladnost (dodatna tablica S4). Genotipizacija je provedena pomoću metode ekonomičnog fluorescentnog označavanja u kojoj se M13 rep dodaje svakoj prednjoj SSR početnici [56]. PCR mješavine su pripremljene u 20 gL reakcije koje sadrže: 50 ng ukupne DNA, 0.2 mM dNTP mješavine, 1X PCR reakcijskog pufera, 0.8 U DreamTaq DNA polimeraze (Thermo Scientific, Waltham, MA, SAD), 0.16 gM reverzne početnice , 0.032 gM prednjeg primera proširenog M13 sekvencom (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') i 0.08 gM univerzalnog M13 primera obilježenog FAM ili NED fluorescentnim bojama (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). PCR reakcije su provedene u termocikleru SimpliAmp (Applied Biosystems, CA, SAD) sa sljedećim uvjetima za većinu parova početnica: 94 °C tijekom 5 minuta, 40 ciklusa na 94 °C tijekom 30 s, 58 °C 45 s i 72 °C 45 s i konačna elongacija na 72 °C 5 min. Što se tiče ACM446 i ACM449, primijenjen je touchdown PCR s žarenjem od 60 °C do 55 °C tijekom 10 ciklusa, 30 ciklusa na 55 °C, nakon čega je uslijedilo konačno produženje od 5 minuta na 72 °C. PCR proizvodi su stavljeni u ploču s 96 jažica i pomiješani s 14 gL Hi-Di Formamida (Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD) i 0.5 gL GeneScan 500 ROX Size Standard (Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD). Amplikoni su razdvojeni pomoću stroja za kapilarno sekvenciranje ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD), gdje su aleli ocijenjeni kao kodominantni i dodijeljeni korištenjem softvera GeneMapper verzija 3.7.
Softver GenAlEx 6.5 [57] i Cervus 3.0.7 [58] korišteni su za procjenu broja alela (Na), broja učinkovitih alela (Ne), uočene heterozigotnosti (Ho), očekivane heterozigotnosti (He), sadržaja polimorfne informacije (PIC), Shannonovog informacijskog indeksa (I) i indeksa fiksacije (Fis ) za svaki SSR lokus.
Procjena genetske raznolikosti
GenAlEx 6.5 procijenio je hijerarhijsku podjelu genetske varijacije između i unutar populacija luka [57] kroz analizu molekularne varijance (AMOVA) s 999 bootstrappingom za testiranje značajnosti. Štoviše, softver GenAlEx 6.5 korišten je za procjenu raznolikosti unutar svake populacije izračunavanjem prosjeka Ho, He i Fis za sve SSR lokuse.
Struktura populacije izvedena je algoritmom klasteriranja temeljenom na Bayesovom modelu implementiranom u softveru STRUCTURE v.2.3.4 [59]. Skup podataka pokrenut je s brojem hipotetskih klastera (K), u rasponu od 1 do 10, postavljajući deset neovisnih ciklusa po svakoj vrijednosti K. Za svaki ciklus, s ciljem provjere konzistentnosti rezultata, provedeno je 100,000 100,000 početnih perioda sagorijevanja i XNUMX XNUMX ponavljanja Markovljevog lanca Monte Carlo (MCMC) prema modelu primjesa i nezavisnim frekvencijama alela među populacijama. Najvjerojatnija vrijednost K određena je primjenom metode AK, koju je opisao [60], u web-baziranom programu STRUCTURE HARVESTER [61]. Pojedinačna populacija je dodijeljena određenom klasteru kada je njen koeficijent pripadnosti (q-vrijednost) bio viši od 0.7, inače se smatralo da ima mješovito podrijetlo.
Analiza glavnih koordinata provedena je kako bi se vizualizirali obrasci genetskog odnosa među primjesama otkriveni Neijevom matricom genetske udaljenosti (dodatna tablica S5). Na temelju frekvencija alela, konstruiran je dendrogram genetske udaljenosti implementacijom metode neponderirane skupine parova s analizom klastera aritmetičkih prosjeka (UPGMA) u softveru POPTREEW [62]. Bootstrapping je primijenjen za procjenu pouzdanosti u hijerarhijsko grupiranje, postavljanjem 100 ponovnog uzorkovanja skupa podataka. Konačno, MEGA X softver [63] korišten je kao softver za crtanje stabla.
Dopunski materijali: Sljedeće su dostupne online na adresi http://www.mdpi.com/2223-7747/9/2/260/s1. Tablica S1: Morfološka karakterizacija ARO, MCO i TRO lukovica. Tablica S2: Heterozigotnost i indeksi fiksacije izračunati za ARO domaće rase i TRO i MCO domaće rase. Tablica S3: Vrijednosti parametra Fpt u paru. Tablica S4: Popis SSR-ova korištenih u studiji. Tablica S5. Parna populacijska matrica Nei genetske udaljenosti. Slika S1: Linijski grafikon K vrijednosti koje se mijenjaju s Evannovom Delta K.
Doprinosi autora: CL i LR su osmislili studiju i dizajnirali eksperiment; CL i PI izvršili su analizu molekularnih markera; ARM i VZ izvršili su terenska ispitivanja; RM, SP, GR i CL bili su uključeni u analizu podataka; RM i CL napisali su rukopis. Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.
Financiranje: Ovaj je rad financirao regionalni apulijski projekt „Bioraznolikost apulijskih vrsta povrća”—Programma di Sviluppo Rurale per la Puglia 2014.-2020. Misura 10—Sottomisura 10.2; potpora CUP H92C15000270002, Italija.
Zahvale: Zahvaljujemo “Azienda Agricola Iannone Anna” i “Associazione produttori della vera cipolla rossa di Acquaviva” za pružanje biljnog materijala korištenog u eksperimentu.
Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Reference
- 1. Stearn, WT Koliko je vrsta Alliuma poznato? Kew Mag. 1992, 9, 180-182. [CrossRef]
- 2. FAOSTAT. FAO statistička baza podataka. Dostupno online: http://www.fao.org/2017 (pristupljeno 8. siječnja 2019.).
- 3. Block, E. Kemija češnjaka i luka. Sci. Am. 1985, 252, 114-119. [CrossRef]
- 4. Lee, B.; Jung, JH; Kim, HS Procjena crvenog luka na antioksidativno djelovanje kod štakora. Food Chem. Toxicol. 2012, 50, 3912-3919. [CrossRef]
- 5. Lee, SM; Mjesec, J.; Chung, JH; Cha, YJ; Shin, MJ Učinak ekstrakata kore luka bogatih kvercetinom na arterijsku trombozu kod štakora. Food Chem. Toxicol. 2013, 57, 99-105. [CrossRef] [PubMed]
- 6. Yoshinari, O.; Shiojima, Y.; Igarashi, K. Učinci ekstrakta luka protiv pretilosti kod zucker dijabetičkih masnih štakora. Nutrijenti 2012, 4,1518-1526. [CrossRef]
- 7. Akaš, MSH; Rehman, K.; Chen, S. Začinska biljka Allium cepa: dodatak prehrani za liječenje dijabetes melitusa tipa 2. Ishrana 2014, 30, 1128-1137. [CrossRef] [PubMed]
- 8. Wang, Y.; Tian, WX; Ma, XF Inhibitorni učinci luka (Allium cepa L.) ekstrakt na proliferaciju stanica raka i adipocita putem inhibicije sintaze masnih kiselina. azijski pak. J. Rak Pret. 2012,13, 5573-5579. [CrossRef] [PubMed]
- 9. Lai, WW; Hsu, SC; Chueh, FS; Chen, YY; Yang, JS; Lin, JP; Lien, JC; Tsai, CH; Chung, JG Kvercetin inhibira migraciju i invaziju SAS stanica raka ljudske usne šupljine putem inhibicije signalnih putova NF-kappaB i matrične metaloproteinaze-2/-9. Anticancer Res. 2013, 33, 1941-1950. [PubMed]
- 10. Nicastro, HL; Ross, SA; Milner, JA Češnjak i luk: Njihova svojstva prevencije raka. Rak Pret. Res. 2015, 8,181-189. [CrossRef]
- 11. Forte, L.; Torricelli, P.; Boanini, E.; Gazzano, M.; Rubini, K.; Fini, M.; Bigi, A. Antioksidativna svojstva i svojstva popravka kostiju kvercetinom funkcionaliziranog hidroksiapatita: Studija kokulture osteoblasta, osteoklasta i endotelnih stanica in vitro. Acta Biomater. 2016, 32, 298-308. [CrossRef]
- 12. Yamazaki, Y.; Iwasaki, K.; Mikami, M.; Yagihashi, A. Distribucija jedanaest prekursora okusa, derivata S-Alk(en)yl-L-cisteina, u sedam Allium povrća. Food Sci. Technol. Res. 2011, 17, 55-62. [CrossRef]
- 13. Block, E. Organosumporna kemija roda Allium—Implikacije za organsku kemiju sumpora. Angew. Chem. Int. ur. engl. 1992, 31, 1135-1178. [CrossRef]
- 14. Griffiths, G.; Trueman, L.; Crowther, T.; Thomas, B.; Smith, B. Luk-globalna korist za zdravlje. Fitoter. Res. 2002,16, 603-615. [CrossRef]
- 15. Schwimmer, S.; Weston, WJ Enzimski razvoj pirogrožđane kiseline u luku kao mjera ljutine. J. Agric. Kem. 1961, 9, 301-304. [CrossRef]
- 16. Ketter, CAT; Randle, WM Procjena ljutine u luku. U Testirani elaborati za laboratorijsku nastavu; Karcher, SJ, ur.; Udruga za biološko laboratorijsko obrazovanje (ABLE): New York, NY, SAD, 1998.; Svezak 19, str. 177-196.
- 17. Hanelt, P. Taksonomija, evolucija i povijest. U Luk i srodne kulture, sv. I. Botanika, fiziologija i genetika; Rabinowitch, HD, Brewster, JL, ur.; CRC Press: Boca Raton, FL, SAD, 1990.; str. 1-26.
- 18. Rabinowitch, HD; Currah, L. Allium Crop Science: Najnoviji napredak; CABI Publishing: Wallingford, UK, 2002.
- 19. Mallor, C.; Carravedo, M.; Estopanan, G.; Mallor, F. Karakterizacija genetskih resursa luka (Allium cepa L.) iz španjolskog secondary center of diversity. Raspon. J. Agric. Res. 2011, 9, 144-155. [CrossRef]
- 20. Ferioli, F.; D'Antuono, LF Procjena fenolnih i cistein sulfoksida u lokalnoj germplazmi luka i ljutike iz Italije i Ukrajine. Genet. Resour. Crop Evol. 2016, 63, 601-614. [CrossRef]
- 21. Petropoulos, SA; Fernandes, A.; Barros, L.; Ferreira, ICFR; Ntatsi, G. Morfološki, prehrambeni i kemijski opis 'vatikiotiko', lokalne domaće sorte luka iz Grčke. Hrana Chem. 2015,182, 156-163. [CrossRef]
- 22. Liguori, L.; Adiletta, G.; Nazzaro, F.; Fratianni, F.; Di Matteo, M.; Albanese, D. Biokemijska, antioksidativna svojstva i antimikrobna aktivnost različitih sorti luka u mediteranskom području. J. Food Meas. Karakter. 2019,13, 1232-1241. [CrossRef]
- 23. Yoo, KS; Pike, L.; Crosby, K.; Jones, R.; Leskovar, D. Razlike u ljutini luka ovisno o kultivarima, okolišu rasta i veličini lukovica. Sci. Hortic. 2006,110, 144-149. [CrossRef]
- 24. Beesk, N.; Perner, H.; Schwarz, D.; George, E.; Kroh, LW; Rohn, S. Distribucija kvercetin-3, 4′-O-diglukozida, kvercetin-4′-O-monoglukozida i kvercetina u različitim dijelovima lukovice luka (Allium cepa L.) pod utjecajem genotipa. Hrana Chem. 2010,122, 566-571. [CrossRef]
- 25. Caruso, G.; Conti, S.; Villari, G.; Borrelli, C.; Melchionna, G.; Minutolo, M.; Russo, G.; Amalfitano, C. Učinci vremena presađivanja i gustoće biljaka na prinos, kvalitetu i sadržaj antioksidansa u luku (Allium cepa L.) u južnoj Italiji. Sci. Hortic. 2014,166, 111-120. [CrossRef]
- 26. Perez-Gregorio, MR; Regueiro, J.; Simal-Gandara, J.; Rodrigues, AS; Almeida, DPF Povećanje dodane vrijednosti luka kao izvora antioksidativnih flavonoida: kritički pregled. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2014, 54,1050-1062. [CrossRef] [PubMed]
- 27. Pohnl, T.; Schweiggert, RM; Carle, R. Utjecaj metode uzgoja i odabira kultivara na topive ugljikohidrate i principe ljutine u luku (Allium cepa L.). J. Agric. Kem. 2018, 66, 12827-12835. [CrossRef] [PubMed]
- 28. Tedesco, I.; Carbone, V.; Spagnuolo, C.; Minasi, P.; Russo, GL Identifikacija i kvantifikacija flavonoida iz dvaju južnotalijanskih kultivara Allium cepa L., Tropea (crveni luk) i Montoro (bakreni luk), te njihovu sposobnost zaštite ljudskih eritrocita od oksidativnog stresa. J. Agric. Kem. 2015, 63, 5229-5238. [CrossRef]
- 29. Villano, C.; Esposito, S.; Carucci, F.; Frusciante, L.; Carputo, D.; Aversano, R. Visokoučinkovita genotipizacija u luku otkriva strukturu genetske raznolikosti i informativne SNP-ove korisne za molekularni uzgoj. Mol. Vrsta. 2019, 39, 5. [CrossRef]
- 30. Mercati, F.; Longo, C.; Poma, D.; Araniti, F.; Lupini, A.; Mammano, MM; Fiore, MC; Abenavoli, MR; Sunseri, F Genetska varijacija talijanske rajčice dugog roka trajanja (Solanum lycopersicum L.) prikupljanje korištenjem SSR i morfoloških svojstava ploda. Genet. Resour. Crop Evol. 2014, 62, 721-732. [CrossRef]
- 31. Gonzalez-Perez, S.; Mallor, C.; Garces-Claver, A.; Merino, F.; Taboada, A.; Rivera, A.; Pomar, F.; Perović, D.; Silvar, C. Istraživanje genetske raznolikosti i svojstava kvalitete u kolekciji luka (Allium cepa L.) domaće rase iz sjeverozapadne Španjolske. Genetica 2015, 47, 885-900. [CrossRef]
- 32. Lotti, C.; Iovieno, P.; Centomani, I.; Marcotrigiano, AR; Fanelli, V.; Mimiola, G.; Summo, C.; Pavan, S.; Ricciardi, L. Genetska, bio-agronomska i nutritivna karakterizacija kelja (Brassica oleracea L. var. acephala) raznolikost u Apuliji, južna Italija. Raznovrsnost 2018,10, 25. [CrossRef]
- 33. Bardaro, N.; Marcotrigiano, AR; Bracuto, V.; Mazzeo, R.; Ricciardi, F.; Lotti, C.; Pavan, S.; Ricciardi, L. Genetska analiza otpornosti na Orobanche crenata (Forsk.) u grašku (Pisum sativum L.) niskostrigolaktonska linija. J. Plant Pathol. 2016, 98, 671-675.
- 34. Wako, T.; Tsukazaki, H.; Yaguchi, S.; Yamashita, K.; Ito, S.; Shigyo, M. Mapiranje lokusa kvantitativnih svojstava za vrijeme vezivanja luka u vezicu (Allium fistulosum L.). Euphytica 2016, 209, 537-546. [CrossRef]
- 35. Dhaka, N.; Mukhopadhyay, A.; Paritosh, K.; Gupta, V.; Pental, D.; Pradhan, AK Identifikacija genskih SSR-a i konstrukcija mape veza temeljene na SSR-u Brassica juncea. Euphytica 2017, 213, 15. [CrossRef]
- 36. Anandhan, S.; Mote, SR; Gopal, J. Procjena identiteta sorte luka pomoću SSR markera. Seed Sci. Technol. 2014, 42, 279-285. [CrossRef]
- 37. Mitrova, K.; Svoboda, P.; Ovesna, J. Odabir i validacija seta markera za diferencijaciju kultivara luka iz Češke Republike. Čeh J. Genet. Biljna pasmina. 2015, 51, 62-67. [CrossRef]
- 38. Di Rienzo, V.; Miazzi, MM; Fanelli, V.; Sabetta, W.; Montemurro, C. Očuvanje i karakterizacija bioraznolikosti germplazme masline u Apuliji. Acta Hortic. 2018,1199,1-6. [CrossRef]
- 39. Mallor, C.; Arnedo-Andres, A.; Garces-Claver, A. Procjena genetske raznolikosti španjolskog jezika Allium cepa domaće sorte za uzgoj luka pomoću mikrosatelitskih markera. Sci. Hortic. 2014,170, 24-31. [CrossRef]
- 40. Rivera, A.; Mallor, C.; Garces-Claver, A.; Garcia-Ulloa, A.; Pomar, F.; Silvar, C. Procjena genetske raznolikosti luka (Allium cepa L.) domaće sorte iz sjeverozapadne Španjolske i usporedba s europskom varijabilnošću. NZJ Crop Hortic. 2016, 44, 103-120. [CrossRef]
- 41. De Giovanni, C.; Pavan, S.; Taranto, F.; Di Rienzo, V.; Miazzi, MM; Marcotrigiano, AR; Mangini, G.; Montemurro, C.; Ricciardi, L.; Lotti, C. Genetska varijacija globalne kolekcije germplazme slanutka (Cicer arietinum L.) uključujući talijanske pristupe kojima prijeti genetska erozija. Physiol. Mol. Biol. Bilje 2017, 23, 197-205. [CrossRef]
- 42. Mazzeo, R.; Morgese, A.; Sonnante, G.; Zuluaga, DL; Pavan, S.; Ricciardi, L.; Lotti, C. Genetska raznolikost brokule rabe (Brassica rapa L. subsp. sylvestris (L.) Janch.) iz Južne Italije. Sci. Hortic. 2019, 253, 140-146. [CrossRef]
- 43. Jakše, M.; Martin, W.; McCallum, J.; Havey, M. Polimorfizmi jednog nukleotida, indeli i jednostavna ponavljanja sekvenci za identifikaciju kultivara luka. J. Am. Soc. Hortić. Sci. 2005,130, 912-917. [CrossRef]
- 44. McCallum, J.; Thomson, S.; Pither-Joyce, M.; Kenel, F. Analiza genetičke raznolikosti i razvoj markera polimorfizma jednog nukleotida u kultiviranom luku temeljen na eksprimiranoj oznaci sekvence-jednostavni markeri ponavljanja sekvence. J. Am. Soc. Hortić. Sci. 2008,133, 810-818. [CrossRef]
- 45. Baldwin, S.; Pither-Joyce, M.; Wright, K.; Chen, L.; McCallum, J. Razvoj robusnih genomskih markera za ponavljanje jednostavne sekvence za procjenu genetske raznolikosti unutar i među lukom (Allium cepa L.) populacije. Mol. Vrsta. 2012, 30, 1401-1411. [CrossRef]
- 46. DeWoody, JA; Honeycutt, RL; Skow, LC Mikrosatelitski markeri kod bjelorepih jelena. J. Hered. 1995, 86, 317-319. [CrossRef] [PubMed]
- 47. Khodadadi, M.; Hassanpanah, D. Iranski luk (Allium cepa L.) reakcije kultivara na inbriding depresiju. Svjetska prim. Sci. J. 2010,11, 426-428.
- 48. Abdou, R.; Bakasso, Y.; Saadou, M.; Baudoin, JP; Hardy, OJ Genetska raznolikost Niger luka (Allium cepa L.) procijenjeno jednostavnim markerima ponavljanja sekvence (SSR). Acta Hortic. 2016,1143, 77-90. [CrossRef]
- 49. Pavan, S.; Lotti, C.; Marcotrigiano, AR; Mazzeo, R.; Bardaro, N.; Bracuto, V.; Ricciardi, F.; Taranto, F.; D'Agostino, N.; Schiavulli, A.; et al. Zaseban genetski klaster u kultiviranom slanutku kako je otkriveno otkrićem markera na cijelom genomu i genotipizacijom. Biljni genom 2017, 2017,10. [CrossRef]
- 50. Pavan, S.; Marcotrigiano, AR; Ciani, E.; Mazzeo, R.; Zonno, V.; Ruggieri, V.; Lotti, C.; Ricciardi, L. Genotipizacija-sekvenciranjem dinje (Cucumis melo L.) zbirka germplazme iz sekundarnog središta raznolikosti naglašava obrasce genetske varijacije i genomske značajke različitih genskih fondova. BMC Genom. 2017, 18, 59. [CrossRef]
- 51. Di Rienzo, V.; Sion, S.; Taranto, F.; D'Agostino, N.; Montemurro, C.; Fanelli, V.; Sabetta, W.; Boucheffa, S.; Tamenđari, A.; Pasqualone, A.; et al. Genetski tok među populacijom maslina u mediteranskom bazenu. Peer J. 2018, 6. [CrossRef]
- 52. Pastir, LD; McLay, TG Dva protokola na mikro razini za izolaciju DNA iz biljnog tkiva bogatog polisaharidima. J. Plant Res. 2011,124, 311-314. [CrossRef]
- 53. Doyle, JJ; Doyle, JL Izolacija biljne DNA iz svježeg tkiva. fokus 1990,12, 13-14.
- 54. Kuhl, JC; Cheung, F.; Qiaoping, Y.; Martin, W.; Zewdie, Y.; McCallum, J.; Catanach, A.; Rutherford, P.; Sudoper, KC; Jenderek, M.; et al. Jedinstveni skup od 11,008 XNUMX oznaka sekvence izražene lukom otkriva izraženu sekvencu i genomske razlike između redova jednosupnica asparagales i poales. Biljna ćelija 2004,16, 114-125. [CrossRef]
- 55. Kim, HJ; Lee, HR; Hyun, JY; Pjesma, KH; Kim, KH; Kim, JE; Hur, CG; Harn, CH Razvoj markera za testiranje genetske čistoće luka pomoću SSR Findera. Korejski J. Pasmina. Sci. 2012, 44, 421-432. [CrossRef]
- 56. Schuelke, M. Ekonomska metoda za fluorescentno obilježavanje PCR fragmenata. Nat. biotehnologija. 2000, 18, 233-234. [CrossRef] [PubMed]
- 57. Peakall, R.; Smouse, PE GenAlEx 6.5: Genetska analiza u Excelu. Softver za populacijsku genetiku za nastavu i istraživanje: ažuriranje. Bioinformatika 2012, 28, 2537-2539. [CrossRef] [PubMed]
- 58. Kalinowski, ST; Konus, ML; Marshall, TC Revidiranje načina na koji računalni program CERVUS prilagođava pogrešku genotipizacije povećava uspjeh u određivanju očinstva. Mol. Ecol. 2007,16, 1099-1106. [CrossRef]
- 59. Pritchard, JK; Stephens, M.; Rosenberg, NA; Donnelly, P. Mapiranje asocijacija u strukturiranim populacijama. Am. J. Hum. Genet. 2000, 67, 170-181. [CrossRef]
- 60. Evanno, G.; Regnaut, S.; Goudet, J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: A simulation study. Mol. Ecol. 2005,14, 2611-2620. [CrossRef]
- 61. Earl, D.; VonHoldt, B. STRUCTURE HARVESTER: Web stranica i program za vizualizaciju STRUCTURE izlaza i implementaciju Evanno metode. Očuvati Genet. Resour. 2011, 4. [CrossRef]
- 62. Takezaki, N.; Nei, M.; Tamura, K. POPTREEW: Web verzija POPTREE za konstruiranje populacijskih stabala iz podataka o učestalosti alela i izračunavanje nekih drugih veličina. Mol. Biol. Evol. 2014, 31, 1622-1624. [CrossRef]
- 63. Kumar, S.; Stecher, G.; Li, M.; Knaz, C.; Tamura, K. MEGA X. Analiza molekularne evolucijske genetike na računalnim platformama. Mol. Biol. Evol. 2018, 35, 1547-1549. [CrossRef]